Illumina測序原理

Illumina測序是一種基于邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis，SBS）的高通量測序技術，其原理主要包括以下幾個步驟：

1. 文庫制備

片段化：將待測DNA片段通過酶切、超聲波打斷等方法隨機打碎成200~800bp的片段。

末端修復與接頭連接：對隨機打斷的雙鏈DNA片段進行末端修復，使其兩端平齊，并在兩端連接上特異性接頭序列。

PCR擴增：對連接了接頭的DNA片段進行PCR擴增，以增加DNA片段的數量。

2. 簇生成（Cluster Generation）

流動槽（Flow Cell）雜交：流動槽表面固定有與接頭互補的寡核苷酸片段，將文庫DNA片段與流動槽表面的寡核苷酸片段雜交。

橋式PCR擴增：通過橋式PCR擴增，將單拷貝DNA分子擴增成簇，形成數百萬個DNA簇。每個簇包含數千個相同的DNA分子，便于光學成像系統捕捉熒光信號。

3. 測序

邊合成邊測序：向反應體系中加入DNA聚合酶、接頭引物和帶有熒光標記的4種dNTP。這些dNTP的3’端羥基被化學方法保護，每次只能添加一個dNTP。

熒光信號檢測：在dNTP被添加到合成鏈上后，洗脫未使用的dNTP和DNA聚合酶，加入激發熒光所需的緩沖液，用激光激發熒光信號，并由光學設備記錄熒光信號。

信號處理與循環：將熒光信號轉化為堿基序列信息，然后加入化學試劑猝滅熒光信號并去除dNTP 3’端羥基保護基團，進行下一輪測序反應。

4. 數據分析

數據處理：將測序產生的數百萬個reads進行處理，通過在文庫構建過程中引入的獨·特index分離不同樣本的序列。

序列拼接與比對：將正向和反向reads配對，生成連續序列，并與參考基因組進行比對分析。

Illumina測序技術因其高通量、低成本、高準確度等優勢，成為目前應用最·廣泛的二代測序平臺。

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